產品名稱：TBD全血單個核細胞分離液 內毒素<0.12EU

產品品牌：天津灝洋/TBD

儲存：常溫保存，有效期2年。啟封后置常溫保存

貨號                      規格          

LDS10750125    200mL   

【實驗前準備】

1.適用儀器

最大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機。

（離心機使用時調整為慢升慢降（具體參數請咨詢離心機廠家）建議升速（指開始啟動→達 到設定離心力）的時間、降速（指設定離心時間完成→機器停止）時間均控制在 3 分鐘 左右。）

2. 抗凝劑的選擇 在動物實驗采血時，很多實驗者選擇醫用真空采xue管獲得抗凝血，醫用采xue管中的抗凝劑只考慮血漿質量，但不利于高純度細胞分離實驗（或必須使用枸櫞·酸鈉的醫用真空抗凝采xue管）

為此，天津灝洋特別開發出抗凝劑及抗凝管專用于細胞分離，改變使用普通采xue管 獲得抗凝血分離效果不佳，提取率及純度低下的不良結果。

分離出的 PBMC 需要進行下一步細胞培養（如培養 NK、CIK 細胞）：選擇肝素抗凝劑。

由于血漿中的纖維蛋白原活化成有活性的纖維蛋白，纖維蛋白交聯成纖維蛋白血凝塊， 易使  PBMC    形成細胞團塊，不利于細胞的活化。肝素Na抗凝劑可減輕上述情況發生幾率。 分離出的  PBMC    無需培養，而是用于其他檢測：選擇枸櫞·酸鈉抗凝劑，分離效果佳。

3. PBMC 最佳分離時間

血液離體后 2 小時內。如達不到 2 小時內分血條件，請務必于 4 小時內進行分血步驟，超過 4 小時很難順利進行分離。

4. 分離液的使用環境

a. 分離液需常溫（37℃-15℃）避光保存，嚴禁冷藏冷凍保存；

b. 使用時嚴格遵守無菌操作規范（超凈工作臺或生物安全柜內），并在 18℃-22℃環境溫 度下進行操作，20℃條件下分離效果佳。超出此溫度范圍，有可能使分離液密度發生 改變，造成分離效果不佳。

5. PBMC 高效離心管（詳見 PBMC 高效離心管使用說明）

6. 參考值（目的細胞參考范圍）

本試劑可保證目的細胞的提取率大于 80%，不是純度。如需獲得高純度目的細胞，請 配合免疫磁珠分選。本試劑盒可減少磁珠的使用量，減少成本。

【檢驗方法】

全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃（試劑需要復溫。夏季 20℃， 冬季 23℃。）的條件下進行。

血液樣本需要稀釋時，實驗方法如下：

稀釋方法：1 份的 PBS 或樣本稀·釋液(產品編號：2010C1119 需另購)加 2 份的血液進行稀釋

（PBS:抗凝血＝1:2）； 注：稀釋液要求：用不含鈣鎂離子的緩沖液或培養基進行血液稀釋。

稀釋圖例

各種規格離心管的使用方法（推薦最佳方法）

取一支無菌離心管，加入分離液，后緩慢加入血液樣本或新鮮抗凝血。血液樣本或 新鮮抗凝血小心加于分離液液界面之上。（若采血量較少，需小量分離，分離液的量不 得少于 3ml，抗凝血量在 0.2-3ml 之間）

1.15ml 離心管（包括高效離心管）：

A. 最佳比例：5ml 分離液+ 4ml 稀釋過的血液；

B. 最佳離心條件：20℃環境下，500g 離心 25min。

2.50ml 離心管（包括高效離心管）：

A. 最佳比例：20ml 分離液+ 20ml 稀釋過的血液；

B. 最佳離心條件：20℃環境下，650g 離心 30min。

未經稀釋的抗凝血分離方法（細胞培養、或需保存血漿推薦用此方法）： 3.使用 15ml 離心管（或 15ml 高效離心管）：

A. 15ml 普通離心管最佳比例：5ml 分離液+ 5ml 抗凝血；

B. 15ml 高效離心管最佳比例：4ml 分離液+ 5ml 抗凝血； C. 最佳離心條件：20℃環境下，600g 離心 25min。

注：獲得純度較高的血漿：離心后，吸取血漿層由上至下的 2/3 處血漿，下 1/3 處血漿可能 包含部分 PBMC 及少量分離液成分；

4.使用 50ml 離心管（或 50ml 高效離心管）：

A. 50ml 普通離心管最佳比例：20ml 分離液+ 20ml 抗凝血；

B. 50ml 高效離心管最佳比例：15ml 分離液+ 20ml 抗凝血；

C. 最佳離心條件：20℃環境下，600g 離心 30min。

注：獲得純度較高的血漿：離心后，吸取血漿層由上至下的 2/3 處血漿，下 1/3 處血漿可能 包含部分 PBMC 及少量分離液成分。

實驗后續方案

1. 離心后，離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環狀乳白色（人）單 個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

2. ①小心吸取血漿層轉移到新離心管 A 中。

②小心吸取離心管中的環狀乳白色（人）單個核細胞層轉移到新離心管  B 中。

3. 向含有（人）單個核細胞的離心管 B 中，加入 10ml 清洗液（產品編號：2010X1118 需 另購），混勻細胞。

4. 250g，離心 10min。棄去上清。

5. 用吸管吸取 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118 需另購）重懸所得細胞。

6. 250g，離心 10min，棄去上清。

重復清洗兩次，棄去上清，用 0.5ml 清洗液（產品編號：2010X1118 需另購）或根據下一步 實驗要求加入相對應液體，重懸所得細胞。

分離圖例

【分離過程中可能出現的情況及處理方案】

情況一：單個核細胞層混雜紅細胞

1.  吸取有紅細胞混雜的單個核細胞層。

2.  取 15 毫升離心管加入紅細胞混雜的單個核細胞層，根據紅細胞殘余數量酌情加入 5-8倍紅細胞裂解液。

a.  如有紅細胞混雜則加入適量紅細胞裂解液（產品編號：NH4CL2009   需另購）將紅細胞裂 解（具體方法見“紅細胞裂解液使用說明"）即得目的細胞。

b. 參考紅細胞裂解液說明書操作。少時多次裂解后獲得單個核細胞。

【注意事項】

1. 關于血液分離液效果討論。

A. 臍帶血：臍帶血收集到細胞分離時長一般大于 2 小時，冷藏存放與運輸在所難免。與 外周血靜脈采血相比，大多臍帶血分離效果較差，為此，灝洋專門開發了臍帶血單個核細胞分離液。

B. 血液個例：每個人都是一個單獨個體，血液也有差異。例如：疾病、藥物、性別、身 體狀況、經期等等。可能出現分離效果較差，目前原因不明確。

C. 案例：應用過免疫動員劑類藥物，普通的樣本密度分離液分離效果較差，有大量的粒 細胞混雜，不能使用。天津灝洋為客戶定制一款專用的樣本密度分離液，PBMC 的提取 率大大提高，純度提高了 50％以上，得到客戶的認可，歡迎廣大醫療及科研用戶致電華雅思創客服 咨詢。

2. 本實驗最好不使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會 變成毛面，影響細胞分離效果。

3. 吸取過多的單個核細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的 粒細胞數量增加。

4. 吸取過多的單個核細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。

5. 不當的稀釋方法會降低細胞得率及活性。稀釋液要求：不含鈣鎂離子的緩沖液或培養基。 血液樣本經過稀釋則分離過程中需適當降低離心力和離心時間。

6. 如實驗后細胞得率或活性過低，請聯系技術支持以尋求幫助。

【儲存條件及有效期】

常溫保存，有效期  2    年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如   4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】 本實驗單個核細胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶可適當進行參考。

【可能存在的問題及解決方法】

1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

2. 離心機離心力、轉速、半徑的換算方法

3. 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地區客戶可根據當地情況對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離 心時間，對離心轉速進行調整。

4. 本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可 能出現紅細胞沉降不完·全的情況，可以適當加大離心轉速。

注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以  50-100g    為基數，直至達到最佳分離效果， 離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。

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